当前，我国进境花卉的数量和品种不断增多，各种花卉携带的植物病毒入侵的风险也大大增加。各种植物病毒一旦传入，则会对我国的花卉种植业以及其它农业生产造成较大或重大的危害。然而由于各…

当前，我国进境花卉的数量和品种不断增多，各种花卉携带的植物病毒入侵的风险也大大增加。各种植物病毒一旦传入，则会对我国的花卉种植业以及其它农业生产造成较大或重大的危害。然而由于各种原因，目前植物病毒在口岸被检验检疫机关截获的机率很低，远远不如昆虫和真菌检出率高。为进一步提高植物病毒的检出率，本文综合前人资料简要综述我国进境花卉病毒的检疫现状及存在的问题。

1 我国对外检疫花卉病毒种类和已截获花卉病毒的种类

目前，我国对外检疫的病毒中可以侵染花卉的有：番茄环斑病毒（一类）、南芥菜花叶病毒（二类）、香石竹坏斑病毒（二类）、李属坏死环斑病毒（二类）、番茄黑斑病毒、烟草脆裂病毒。进境花卉品种主要有郁金香、惠兰、剑兰、百合、巴西铁、风信子，满天星、红掌等。从荷兰、日本、韩国、美国、以色列、澳大利亚、德国等国家引进。我国各口岸检验检疫机关曾多次从进境花卉里截获病毒，例如：从德国虞美人花卉中检测到李痘病毒。从日本月季上检测到番茄黑斑病毒，从荷兰、德国、日本等国的唐菖蒲、菊花、飞燕草上检测到南芥菜花叶病毒，从日本香石竹上检测到香石竹斑驳病毒，从台湾石解兰上检测到建兰花叶病毒，从德国鼠尾草中检测出番茄环斑病毒、南芥菜花叶病和烟草环斑病毒，还曾经截获大丽菊花叶病毒、黄瓜花叶病毒、菊花B病毒、菜豆黄化花叶病毒、树兰花叶病毒、鸢尾黄花叶病毒、大戟花叶病毒、马铃薯Y病毒、烟草花叶病毒、建兰轻性花叶病毒等。

2 花卉病毒检测技术及应用

植物病毒的检疫方法有：生物学方法、物理学测定方法、生物化学方法和分子生物技术。生物学方法是传统的病毒检测技术，具有检测周期长、准确性较高的特点。生物化学方法主要是利用琼脂双扩散、酶联免疫吸附实验、免疫电泳和免疫电镜等实验技术对植物病毒进行快速诊断；分子生物技术主要是利用核酸分子杂交技术、单克隆抗体技术及PCR技术等方法进行检测。由于传统的生物学检疫方法和电子显微镜检疫法很费时间，不适于口岸的快速检测鉴定的要求，所以这里主要谈一下生物化学和分子生物技术在检疫病毒快速检测的应用。

2.1 血清学方法

酶联免疫吸咐法是病毒检测的常用技术手段。目前，植物检疫部门主要使用的是A蛋白酶联吸咐法（SPAELISA）和双抗体夹心酶联吸咐法（DAS-ELISA）。谢为龙等人（1995年）采用A蛋白酶联法检测出进境兰花携带的建兰花叶病毒（CyMV）。魏梅生等人（2000年）采用动物碱性磷酸酯酶来标记A蛋白检测香石竹斑驳病毒、马铃薯病毒、烟草环斑病毒、南方菜豆花叶病毒，使用1／2000的酶标仍可有效地检测到200ng／ml的提纯病毒。李明福（1993年）应用A蛋白酶联吸附法对进口兰花病毒进行检测，采用两种酶系统———辣根过氧化物酶及青霉素酶系统，从舞女兰中检测出建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒，从惠兰中检测出建兰花叶病毒。

在ELISA方法，常用的酶系统有碱性磷酸酶／硝基苯磷脂，辣根过氧化物酶／邻苯二胺等，植物材料中常含有过氧化物酶，而一般不含青霉素酶，所以在实验中采用青霉素酶的ELISA检测中的假阳性反应出现的机会小于采用过氧化物酶。陈京等人（1997年）用含2μg／ml的A蛋白的碳酸缓冲液包被聚乙烯酶联板在存放3个月、半年、1年后用SPA-ELISA法测番茄坏斑病毒病汁液，不同保存期的包被板检测的阳性和阴性OD数值趋势基本无变化。陶庭典等（2001年）应用双抗体夹心酶联吸咐法检测香石竹环斑病毒，灵敏度可达4ng／ml的纯病毒。DASELISA检测香石竹环斑病毒具有相当高的灵敏度，人工接种的香石竹在还没有表现出香石竹坏斑病毒症状时已经能够用该方法检出香石竹环斑病毒。郑平等人（1999年）采用组织涂抹抗血清酶联免疫吸附技术，对进口的大花蕙兰、石斛兰、蝴蝶兰、卡特利亚兰、文心兰等10多个品种进行病毒检测。结果表明，引入品种中蕙兰花叶病毒总感病率为38%，齿舌兰属环斑病毒总感病率为27.7%，其中蝴蝶兰、卡特利亚兰、文心兰的两种病毒感病率较高。

由于使用ELISA试验手续较繁琐、测定时间较长，采用硝酸纤维膜为固相载体进行的ELISA试验即斑点免疫吸咐试验（DIB）在病毒检测中得以广泛应用。同ELISA和其它血清学方法相比，斑点法具有步骤简单，测定时间短，需样品量小，易于目测结果等优点。陶庭典等人（1992年）用DIB方法检测出从日本、荷兰进口的香石竹中的香石竹斑驳病毒，检测到样品稀释度可达1:1000。由于口岸检疫条件的限制，检疫技术要求简便、快速、灵敏。ELISA试剂盒适于口岸检疫部门进行植物病毒的快速检测鉴定。孔宝华等人（2000年）选用美国Agdia公司的番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒、烟草环斑病毒、香石竹坏斑病毒等ELISA试剂盒，利用双抗夹心法进行实验，从德国鼠尾草中检测出番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒和烟草环斑病毒。陈京等（1997年）研制出番茄环斑病毒、烟草花叶病毒和南芥菜花叶病毒的A蛋白酶诊断试剂盒，并提供给南京、广州、昆明等口岸检验检疫局试用。

2.2 分子生物学方法

（1）PCR技术。多聚酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。该方法具有灵敏度高、特异性强的优势，已用于多种植物病毒的诊断的检测。孔宝华等（2000年）利用RT-PCR技术检测李坏死环斑病毒，得到大小约为450bp的扩增目的片段。孔宝华等人（2002年）采用RT-PCR技术检测香石竹斑驳病毒，最低RT-PCR检出浓度是RNA含量为5ng。吴红芝等人（2002年）采用RT-PCR技术从菊花中检测出番茄不孕病毒，灵敏度为10-5。闻伟刚等人（2003年）建立了一步RT-PCR检测南芥菜花叶病毒的方法，采用Trizol快速提取植物叶片总RNA，通过设计特异性引物并利用一步RT-PCR技术，对ArMV能够扩增出分子量为370bp的特异性条带，经测序验证，该产物与ArMV外壳蛋白基因中的目标序列之间存在90.5%的一致性。

（2）核酸子杂交技术。该技术的基本原理是：具有一定同源性的2条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则退火形成双链，分子杂交灵敏度高，特异性强。此杂交过程是高度特异性的，所用探针必须标记，以便示踪和检测，最初的核酸杂交试验是用放射性同位素（如32P）来标记探针，近几年来应用非放射性探针分子，如生物素或地高辛标记的探针分子，更安全，应用限制更少，寿命更长。陈定虎等人（1997年）应用核酸技术，在分子水平上对香石竹环斑病毒进行检测。采用放射性同位素和光敏生物素标记的cDNA探针都可以检测出香石竹环斑病毒，且准确性好，检测RNA极限达到1ng／ml。

3 存在问题及探讨

目前，植物病毒的检测方法对口岸检疫部门要求较高，很多一线检疫部门不具备开展病毒检测工作的条件。传统的生物学检测方法所需时间太长，不适于口岸部门进行检测。电子显微镜技术和酶联免疫吸咐法所需时间长，手续繁琐，既需要提纯病毒，还需要一定的仪器设备和药品才能开展工作，同时对技术人员水平要求较高。PCR技术和核酸探针技术虽然可以快速检测植物病毒，并且灵敏度较高，但同样由于仪器设备和药品材料等限制，未能广泛应用于口岸检测中。ELISA诊断试剂盒能够快速检测，操作简便，可进行大量样品的检测，但价格昂贵，检测成本太高，没有广泛应用。ELISA诊断试剂盒如能够进一步降低成本、提高灵敏度、降低假阳性出现的可能性、方便快捷，则必然能够有助于提高植物病毒的检出率。我国植物病毒检测主要集中在国家局、云南局、上海局和秦皇岛局等，很多一线口岸部门并未开展有关工作。随着我国花卉进口量日益增大，各种花卉携带的植物病毒入侵的风险也大大增加，如何快速、有效、经济的检测植物病毒成为植检部门的重要课题。笔者认为想要提高植物病毒检出率，就要高度重视植物病毒的检测工作，加大仪器设备的投入力度，加强对植物病毒检测技术的培训，进一步改进检测技术。有的植检人员对植物病毒的危害缺乏足够的重视，建议适时组织有关人员集中培训病毒知识，为检出率的提高打好基础。目前，植物病毒的检测出率远远低于昆虫、线虫、真菌的检出率，这虽然与各种有害生物的传播途径不同有关，但植物病毒检测对仪器设备等条件要求较高确实限制了病毒检出率的提高。只有快速、有效、经济的检测方法才适于口岸一线部门的实际情况，拒各种复杂的植物病毒于国门之外。